Automatisierte UV-Spektralphotometrie
Das NanoDrop bietet eine Messung der Absorption von etwa 200 nm bis 350 nm, was dem relevanten Bereich zum Bestimmen der Konzentration und Reinheit von RNA/DNA entspricht.Ein NanoDrop-Spektrophotometer ist ein gängiges Laborgerät, das die Konzentration von DNA, RNA und Protein in einem 2-µL-Tropfen auf einem Sockel messen kann . Ein so kleines Probenvolumen bedeutet weniger Vorbereitungs- und Reinigungszeit und ermöglicht die Messung mehrerer Proben in weniger als einer Minute im Vergleich zur Verwendung einer herkömmlichen 1-cm-Küvette.Der Nanodrop sollte über eine Option verfügen, mit der Sie einen „Extinktionskoeffizienten“ eingeben können. Dies ist ein Maß dafür, wie viel ein Mol Ihres Proteins bei 280 nm absorbiert. Der Nanodrop verwendet diesen Wert, um Ihnen einen genauen Konzentrationswert zu liefern.
Was kostet ein NanoDrop : Thermo NanoDrop One ND-ONE W Mikrovolumen-UV/VIS Spektrometer 1000 20, 11.305,00 €
Wie interpretieren Sie die Nanodrop-Ergebnisse für Protein
Ein Verhältnis von ~1,8 wird allgemein als „rein“ für DNA akzeptiert; Ein Verhältnis von ~2,0 wird allgemein als „rein“ für RNA angesehen. Wenn das Verhältnis in beiden Fällen deutlich niedriger ist, kann dies auf das Vorhandensein von Protein, Phenol oder anderen Verunreinigungen hinweisen, die bei oder in der Nähe von 280 nm stark absorbieren .
Wie berechnet Nanodrop die DNA-Konzentration : Zwei Mikroliter (µl) DNA werden in 98 µl Wasser verdünnt und die Absorption wird bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm gemessen. Die ungefähre Menge der Nukleinsäure in der Probe wird anhand der folgenden Formel berechnet: DNA-Menge in ng/μl = Absorption bei 260 der Probe × 50 (Maniatis et al., 1989).
Protein quantification
Scientists can use NanoDrop instruments to quantify the protein content in their sample using either direct or indirect measurements.
Das Absorptionsverhältnis bei 260 nm und 280 nm wird zur Beurteilung der Reinheit von DNA und RNA verwendet. Ein Verhältnis von ~1,8 wird allgemein als „rein“ für DNA akzeptiert; Ein Verhältnis von ~2,0 wird allgemein als „rein“ für RNA angesehen.
Wie funktioniert A280
Die Proteinkonzentration kann durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm abgeschätzt werden ; Proteine zeigen hier aufgrund der Absorption von Tryptophan- und Tyrosinresten (allgemein als A 280 bezeichnet) einen starken Peak. Dies kann mithilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes leicht in die Proteinkonzentration umgerechnet werden (siehe Gleichung unten).NanoDrop Mikrovolumenspektrophotometer | Thermo Fisher Scientific – USA.Das optimale Verhältnis von 260/280 hängt davon ab, was Sie messen: RNA oder DNA. Diese Werte sind wie folgt: DNA: 1,80 . RNA: 2,00 .
Die DNA-Konzentration wird geschätzt, indem die Absorption bei 260 nm gemessen wird, die A 260- Messung an die Trübung angepasst wird (gemessen anhand der Absorption bei 320 nm), mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert wird und die Beziehung verwendet wird, dass ein A 260 von 1,0 = 50 µg/ml reine dsDNA.
Was bedeuten die Nanodrop-Werte : Das A260/230-Verhältnis weist auf das Vorhandensein organischer Verunreinigungen hin , wie beispielsweise (aber nicht beschränkt auf): Phenol, TRIzol, chaotrope Salze und andere aromatische Verbindungen. Proben mit 260/230. Bei Verhältnissen unter 1,8 wird davon ausgegangen, dass sie eine erhebliche Menge dieser Schadstoffe enthalten. beeinträchtigen nachgelagerte Anwendungen.
Was bedeutet das A260-A280-Verhältnis : In der Vergangenheit wurde das Verhältnis dieses Absorptionsmaximums zur Absorption bei 280 nm sowohl bei DNA- als auch bei RNA-Extraktionen als Maß für die Reinheit verwendet. Ein 260/280-Verhältnis von ~1,8 wird allgemein als „rein“ für DNA angesehen; Ein Verhältnis von ~2,0 wird allgemein als „rein“ für RNA angesehen.
Wie misst man die Proteinkonzentration mit A280
Verwenden Sie die folgende Formel, um die Proteinkonzentration grob abzuschätzen. Die Pfadlänge beträgt bei den meisten Spektrometern 1 cm. Konzentration (mg/ml) = Absorption bei 280 nm dividiert durch Weglänge (cm). Reines Protein mit bekanntem Absorptionskoeffizienten .
Protein-Reinheitsverhältnis 260/280
Ein ideales 260/280-Verhältnis für gängige Proteine beträgt 0,6 . Höhere Verhältnisse können auf eine Kontamination isolierter Proteine mit DNA hinweisen.Das NanoDrop® ND-1000 UV-Vis-Spektrophotometer ist ein Spektrophotometer, das hochpräzise Analysen von 1-ul-Proben für DNA, RNA, Proteine, Pigmente, das gesamte UV-sichtbare Spektrum (220–700 nm) und Zelldichtetests mit bemerkenswerter Reproduzierbarkeit ermöglicht.
Wie interpretieren Sie die Nanodrop-Ergebnisse : Interpretation: Dieses Beispiel ist für nachgelagerte Anwendungen geeignet. Die RNA-Probe unten weist ein gutes A260/280-Verhältnis auf, was darauf hindeutet, dass keine Proteinverunreinigungen vorhanden sind. Das A260/230-Verhältnis von 1,29 liegt jedoch deutlich unter 2, was darauf hindeutet, dass in der Probe irgendeine Art von organischen Verunreinigungen vorhanden ist.